离心超滤管怎么使用?

1、选择合适的超滤离心管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤离心管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤离心管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤离心管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速rpm换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。

（1）选择合适的超滤管。通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同。
（2）新买来的超滤是干燥的，使用前加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
（3）平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速  rpm换算成g之后，有所不同。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
（4）当浓缩到剩下1ml时，取50ul缓冲溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mgml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的缓冲溶液，直到蛋白不发生沉淀为止。
（5）前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再  浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。

离心管就是一个简单的可以承受高转速压力的管子，比如离一些样品，分离出上清沉淀。
离心超滤管会有一个类似于内管和外管的两个部分，内管中是带有一定分子量的膜，当高速离心时，分子量比它小的就漏到下面的管子（即外管）中了，分子量比它大的就截留在上面（即内管中），就是超滤的原理。。。。常用于浓缩样品。

超滤管使用方法和注意事项
  
蛋白浓缩和换
Buffer
通常使用的超滤管，常用
Millipore
的
Amicon-Ultra-15
超滤管
（
MWCO10kD
）。也有其它型号的、不同体积大小和
MWCO
超滤管可选，视目的蛋白的分子量
与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
  
1
、
选择合适的超滤管，
主要考虑
MWCO
和浓缩体积，
通常应截留分子量不应大于目的蛋
白分子量的
1/3
，比如目的蛋白分子量为
35kDa
，就可以选择
10kDa
截留分子量的超滤管。
若目的蛋白分子量为
10kD
左右，则可以用截留分子量
3kD
的超滤管。
  
2
、
新买来的超滤是干燥的，
使用前加入
MilliQ
水，
水量完全过膜，
冰浴或冰箱里预冷
几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要
轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
  
3
、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏
超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至
4
度）。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心
机的情况是膜与轴垂直）
。
在实际使用中，
一般转速开的比说明书里的要低，
这样可以延长
离心管的使用寿命。
  
4
、当浓缩到剩下
1ml
时，
【取
50ul
国产
Bradford
溶液，加入
10ul
流穿，看有没变蓝
色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。
要精确判断是否漏管，
用
5mg/ml
的
BSA
离心
10min
，
再取流穿，
跑蛋白胶或
Bradford
粗测】
，
继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。
离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，
导致堵管。
若发生沉淀，
要确定沉淀的具体原因，
是蛋
白浓度过高还是
Buffer
不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后
者的方法是换不同的
Buffer
，直到蛋白不发生沉淀为止。
  
5
、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换
Buffer
，在总蛋白液浓缩至
1ml
左右的时候，轻
轻加入新的
Buffer
（经
0.22um
超滤膜超滤），再浓缩至
1ml
左右，连续三次，最后一次的
浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于
500ul
，也有浓缩至
200ul
以内的情况。
按照每次至少
10
倍左右的体积浓缩算，三次达到
1000
倍以上，基本上可以达到换
buffer
的目的。
  
6
、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（
200ul
）取，轻轻顺着边缘插入
枪头，
轻轻吹打、
混匀蛋白液，
注意不要碰到超滤膜，
然后吸取浓缩液，
每次吸接近
200ul
，
直到吸完。
管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，
否则难度太大，有可能损坏超滤膜。
最后
加入
MilliQ
水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。
  
7
、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
  
8
、倒出超滤管里的水，用
milliQ
水轻轻润洗几次，
【若管底有可见的蛋白沉淀，可以
先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水
猛冲】然后加入
0.2M
的
NaOH
溶液，室温放置
20min
，期间平衡超滤管。再离心
10min
。倒
出残留的
NaOH
溶液，将管芯浸入
MilliQ
水的烧杯
(1
或
2L)
中
,
放置几个小时
,
再换新的水
,
放置几个小时，不断稀释
NaOH
浓度。
50ml
管和盖子用自来水洗，内壁再用
MilliQ
水洗干
净。
  
9
、取出浸没的管芯，加至接近满的
MilliQ
水，
50ml
管也加满
MilliQ
水，将管芯慢慢
放入
50ml
离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放
4
度保存，直到下次使用。一般来说，
按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。

方法如下：法一：离心收集管，倒转滤膜放置方向，加入所需体积的目的溶剂，放置一会离心即可。法二：用硫酸胺沉淀得到IgG,需要透析至无NH4,  再冰冻干燥即可。希望可以帮助到您。

倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净，再取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放度保存。